## TOPO克隆PCR产物的纯化与回收

在完成PCR反应后，需对产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，以确认是否存在目标大小的条带。推荐使用切胶回收法进行纯化，切胶过程应控制在3分钟以内，以减少紫外光对DNA的损伤。收集的DNA浓度应通过NanoDrop或OneDrop等仪器检测，确保浓度达到≥30ng/μl。随后，再次进行凝胶电泳确认仅存在目标条带。

### 目的片段连接至载体

连接反应体系应按照说明书要求配置，各组成部分的投入量不应少于1μl。如果浓度过高，可以对样品进行稀释。连接反应的温度可选择25°C或37°C，时间为5分钟；若出现克隆失败或假阳性，可以尝试延长至30分钟。

### 感受态细胞的转化和涂板

在转化连接产品时，推荐使用DH5α或Fast-T1等化学感受态细胞。切忌反复冻融感受态细胞，建议在-80°C取出后一次性使用。重组产物与感受态细胞的体积比例应为1:10，推荐将10μl的重组产物加入至100μl感受态细胞中，或5μl的重组产物加入至50μl感受态细胞中。

热激时间应依据感受态细胞的说明书进行操作。涂板所用的抗生素应与转化载体的抗性保持一致。在涂板时，将菌液以2500×g离心3分钟，吸去多余的LB培养基后，保留100μl重悬液并全部涂板，也可以根据需要吸取适量体积进行涂布。

### 单克隆菌落PCR鉴定

选择平板中大小适中的单克隆菌落进行挑取，避免过大或过小的菌落。可以挑取若干单克隆菌落进行鉴定分析，将挑取的菌落放入已添加10μl ddH2O的EP管中混匀后，吸取1-2μl用于PCR反应（10/20μl体系）。推荐使用位于片段和载体上下游的一对引物进行PCR鉴定。

如模板中存在Amp或Kana抗性的质粒，应对目的片段进行切胶回收。我们致力于提供生物医药领域的优质产品和技术服务，助力基因治疗与细胞治疗的发展。

## 关于Z6·尊龙凯时

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