IPS诱导肠类器官的培养过程可以分为三个主要阶段：人多能干细胞的培养、内胚层分化及中/后肠模式化诱导，以及类器官的培养。本文将重点介绍第二阶段——内胚层分化及中/后肠模式化诱导。

一、前期准备

1. 试剂与设备

在进行内胚层分化及中/后肠模式化诱导前，需准备以下试剂和设备：

• 细胞：H1/H9 hESC或患者来源的iPSCs。
• 培养基：人多能干细胞培养基（abs9403）、RPMI1640（abs9484）。
• 消化液：人多能干细胞消化液（abs9409）。
• 培养基添加剂：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM）（abs9295）、双抗（abs9244）。
• 生长因子：Activin A（100 ng/mL）（abs05801）、FGF4（500 ng/mL）（abs06269）、WNT3a（500 ng/mL）（abs05632）。
• 基质胶：即用型基质胶（培养板包被）（abs9410）、类器官专用基质胶（abs9495）。
• 血清：透析胎牛血清（abs945）。
• 关键设备：表面培养皿、立体显微镜、无菌手术刀、预冷微量离心管。

2. 试剂配制

内胚层分化培养基的制备如下：

• Day1： RPMI1640 + L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液（2mM） + 双抗（1%） + Activin A（100 ng/mL）。
• Day2： Day1配方 + 透析胎牛血清（0.2%）。
• Day3： Day1配方 + 透析胎牛血清（2%）。

中/后肠分化培养基的制备为：

• RPMI1640 + 透析胎牛血清（2%） + FGF4（500 ng/mL） + WNT3a（500 ng/mL）。

二、hPSCs传代与铺板

1. 细胞传代（耗时2小时）

使用人多能干细胞消化液处理hPSCs，待细胞边缘微卷。然后用细胞刮刀轻柔剥离细胞团，反复吹打至1-2mm大小细胞团，将其按1:6的比例接种至Matrigel包被的24孔板，每孔约5000个细胞团。轻轻敲打培养板以确保细胞均匀分布，37°C条件下培养过夜。

2. 细胞扩增至85-90%融合（3-4天）

每日更换人多能干细胞培养基，并观察细胞密度。注意：若细胞密度过高（易发生自发分化）或过低（分化效率低），需重新铺板。

三、内胚层分化（3天）

步骤如下：

1. Day1：去除人多能干细胞培养基，加入Day1内胚层培养基（无血清），培养24小时。
2. Day2：更换为Day2内胚层培养基（含0.2%透析胎牛血清），继续培养24小时。
3. Day3：更换为Day3内胚层培养基（含2%透析胎牛血清），培养24小时。
4. 验证分化效率（可选）：进行免疫染色以检测FOXA2/SOX17双阳性细胞，效率应达到85-90%。

四、中/后肠模式化（3-4天）

1. 诱导球状体形成

更换为中/后肠分化培养基，并每日更换培养基。培养48小时后，利用立体显微镜观察上皮增厚，72-96小时后观察球状体（spheroids）从单层细胞中脱离。

2. 收集球状体

使用200μL枪头收集游离球状体，每管约50个，并置于冰上备用。

在此过程中，您可以考虑使用Z6·尊龙凯时相关产品，以优化您的实验室操作和结果。我们推荐使用以下主要试剂：

• 人多能干细胞培养基：abs9403（500ml）
• 人多能干细胞消化液：abs9409（100ml）
• L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液：abs9295（100×，200mM，100ml）
• 透析胎牛血清：abs945（500ml）

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